O B A V I J E S T

Javna obrana doktorskog rada studenta doktorskog studija BIOFIZIKA

IVANA MARDEŠIĆA, mag. phys.

pod naslovom  “Učinak korištenja vlažnih lipidnih filmova, dobivenih fuzijom vezikula, na elektroformaciju divovskih unilamelarnih vezikula s obzirom na različite lipidne sastave i naboj, koncentraciju kolesterola i ionsku snagu otopine”

održat će se u ponedjeljak, 10. ožujka 2025., u 14.00 sati na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu u Splitu, u amfiteatru A1-1, pred članovima Stručnog povjerenstva:

1.    doc. dr. sc. Lucija Krce, Prirodoslovno-matematički fakultet u Splitu – predsjednica

2.    izv. prof. dr. sc. Željka Sanader Maršić, Prirodoslovno-matematički fakultet u Splitu – članica

3.    doc. dr. sc. Martina Perić Bakulić, Kemijsko-tehnološki fakultet u Splitu –  članica

4.    prof. dr. sc. Ante Bilušić, Prirodoslovno-matematički fakultet u Splitu – zamjenski član

Mentorica:

prof. dr. sc. Marija Raguž – Medicinski fakultet u Splitu.

Pozivaju se svi zainteresirani da prisustvuju obrani doktorskog rada.

Naslov:  Učinak korištenja vlažnih lipidnih filmova, dobivenih fuzijom vezikula, na elektroformaciju divovskih unilamelarnih vezikula s obzirom na različite lipidne sastave i naboj, koncentraciju kolesterola i ionsku snagu otopine

SAŽETAK: 

Dugoročni cilj ovog rada je istraživanje svojstava čiste kolesterolove domene. Prije početka eksperimentalnog rada, istražili smo literaturu te napisali detaljni pregledni članak o različitim membranskim modelima i eksperimentalnim tehnikama prikladnima za istraživanje tih domena. Sva poznata svojstva i funkcije čiste kolesterolove domene su opisane. Glavna motivacija za istraživanje su istraživanje funkcija domene u leći oka, gdje ta domena omogućuje homeostazu stanice i ima zaštitnu funkciju tijekom razvoja katarakte. Odlučili smo koristiti divovske unilamelarne vezikule (DUV) kao prikladan model za stanične membrane vlaknastih stanica leće oka. DUV-ovi se koriste kao membranski modeli za istraživanje osobina bioloških membrana, pri čemu je elektroformacija najčešće primjenjivana metoda za njihovo formiranje. Međutim, mnogo čimbenika može utjecati na uspjeh elektroformacije DUVova. Neki od izazova uključuju upotrebu visoke koncentracije kolesterola, nabijenih lipida i korištenje otopine s ionskom snagom. Visoke koncentracije kolesterola predstavljaju poseban problem za tradicionalni protokol, koji uključuje sušenje lipidnog filma. Tijekom ovog procesa mogu se formirati kolesterolovi kristali koji se ne ugrađuju u vezikulu, što rezultira nižom koncentracijom kolesterola u vezikuli nego u izvornoj smjesi lipida. Kako bismo se riješili problemom izlučivanja kolesterola, modificirali smo protokol elektroformacije korištenjem različitih metoda kao što su: brza izmjene otapala, sonikacija, čišćenje elektrode plazmom i brzo razmazivanje. Modificirani elektroformacijski protokol omogućuje reproducibilnu proizvodnju DUV-ova za različite omjere kolesterola i 1-palmitnska-2-oleoinska-sn-glicero 3-fosfokolina (POPC) od 0 do 2.5, uz minimiziranje izlučivanja kolesterola. Za omjere kolesterol/POPC veće od 1.5 izmjeren je pad drastični promjera DUV-ova. Promjer se smanjio oko 40% u usporedbi s čistom POPC membranom. Osim formiranja DUV-ova s visokom koncentracijom kolesterola, uspješno smo formirali DUV-ove koristeći nabijene lipide (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3- fosfo-L-serin, POPS) i ionske otopine s niskom koncentracijom NaCl-a.

Title:  The effect of using wet lipid films, obtained by vesicle fusion, on electroformation of giant unilamellar vesicles with respect to different lipid compositions and charge, cholesterol concentration, and solution ionic strength

ABSTRACT: 

The long-term aim of this research is to investigate the properties of cholesterol bilayer domains (CBDs). Before starting experimental work, we conducted a detailed literature search and wrote a review article about all membrane models and experimental methods suitable for studying properties of CBD domains. We also described in details their known properties and functions in biological membranes. Our motivation stemmed from the beneficial role of CBDs in protecting the eye lens from cataract development and maintaining its homeostasis. Based on this knowledge we chosen giant unilamellar vesicles (GUVs) as an appropriate model for studying lipid portion of the fiber cell plasma membranes of the eye lens. GUVs are widely used as membrane models in studies of membrane properties, with the electroformation method being the most common approach for their production. However, several factors can affect the success of GUV electroformation. Common challenges include high cholesterol (Chol) concentrations, the use of lipid mixtures containing charged lipids, and solutions with elevated ionic strength. High Chol concentrations pose a particular problem for the traditional electroformation protocol, which involves drying the lipid film by fully evaporating the organic solvent. During this process, anhydrous Chol crystals can form, which do not integrate into the lipid bilayer, resulting in a lower Chol concentration in the vesicle bilayer compared to the original lipid mixture. To address the issue of artifactual Chol demixing, we have modified the electroformation protocol by introducing rapid solvent exchange, ultrasonication, plasma cleaning, and spin-coating techniques for the reproducible production of GUVs from damp lipid films. A high yield of GUVs was achieved for Chol/1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) samples with mixing ratios ranging from 0 to 2.5. At Chol/POPC mixing ratios greater than 1,5, where the GUVs may contain Chol bilayer domains (CBDs), a significant decrease in the average GUV diameter is measured. It is about 40% lower compared to that of the pure POPC bilayer. This modified approach not only minimizes Chol demixing but also successfully produces GUVs from lipid mixtures containing charged lipids and ionic solutions as the internal medium. We prepared GUVs from mixtures with up to 60 mol% of the charged lipid 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) and formed GUVs in lowconcentration NaCl solutions.